两个小孩

巨细胞病毒感染耳蜗上皮细胞差异表达的miRNA筛选及验证

2021-04-28 15:02:45 来源: 中华耳科学杂志字体[ ]

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中华耳科学杂志, 2021年19卷1期

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巨细胞病毒感染耳蜗上皮细胞差异表达的miRNA 筛选及验证

李俎怡 何蓉

耳聋是影响人类健康和致残的常见疾病,据统计平均每1000 个新生儿中就有1-3 个耳聋患者[1,2]。耳聋可以由基因突变引起,也可由环境因素(如细菌感染、病毒感染、声损伤等)或基因和环境互相作用引起[3]。其中50% 的耳聋被认为与环境因素有关[4]。研究表明,儿童的中、重度耳聋30% 与先天性巨细胞病毒(Cytomegalo virus,CMV)感染有关[5]。

巨细胞病毒,是一种具有双链DNA的疱疹病毒,属于疱疹病毒B 亚科,且具有种属特异性。CMV 感染在人群中普遍存在,新生儿出生时感染率达0.2%—0.3%[6]。先天性CMV 感染已被证实是婴幼儿非遗传性感音神经性聋(Sensorineural hearing loss ,SNHL)的最主要原因。大多数情况下的SNHL 发生伴有耳蜗感觉毛细胞和神经结构受损。CMV 感染内耳有多种途径,传染性病原体既可以通过与耳蜗外淋巴隔室相邻的大脑脑室储液池进入内耳,也可以通过圆形窗口和血液途径进入耳蜗。以前的研究表明,外周(腹膜内)接种CMV 也可导致中枢神经系统和耳蜗感染[7]。CMV 感染内耳的多种途径为研究CMV 致聋建立动物模型提供了方法。目前,最常用于耳毒性研究的细胞模型是源自ImmortomouseTM内耳的OC-k3 细胞系。OC-k3 细胞不表达神经元标记,因此它们是毛细胞的假定前体细胞[8]。选择CMV 感染小鼠耳蜗感觉上皮细胞(OC-k3 细胞系)模型具有一定技术优势,其原代细胞的生物性状不会发生很大的改变,这一定程度上反映了它们在体内的状态,表现出原组织或细胞的特性。且原代细胞的基因表达分析能使研究者更好的理解生物学通路和疾病进程。

近年来,随着高通量测序及生物信息技术的迅猛发展,使得研究microRNA 在听觉系统的发育和功能中的作用已经成为一个研究领域的热点。微小RNA(microRNA, miRNA)是小的非编码RNA,其通过RNA 干扰(RNAi)途径发挥功能,并在转录后调节真核生物中的基因表达。miRNA 在哺乳动物的内耳中表达丰富,并且某些miRNA 在进化上与感觉细胞的发育和功能相关,miRNAs 是内耳胚胎发育和出生后毛细胞命运维持所必需的[9]。自从1993 年被发现以来,已鉴定出许多在内耳和外耳的正常发育中起作用的miRNA[10]。尽管已知miRNA 影响细胞增殖,分化和形态发育,但尚未对其表达或在哺乳动物内耳发育中的作用进行论述。本研究拟通过筛选巨细胞病毒感染小鼠耳蜗感觉上皮细胞和正常小鼠耳蜗感觉上皮细胞差异表达的miRNA,以探索miRNA 在mCMV 感染小鼠耳蜗感觉上皮细胞中的作用及其调控机制。


1 材料与方法


1.1 细胞系,病毒,及主要试剂

小鼠巨细胞病毒(mouse Cytomegalo virus,mCMV)Smith 株来自中国医科大学病毒研究所,小鼠耳蜗上皮细胞(Mouse cochlear epithelial cells,MCEC)oc-k3 细胞系购自于上海抚生生物技术有限公司。DEMD 高糖培养基,胎牛血清,PBS 等购自以色列BI公司,PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成,miRNA First-strand cDNA Synthesis,SuperMix Top qPCR SuperMix等miRNA 反转录及荧光定量PCR 试剂盒购自中国全式金生物公司。

1.2 细胞培养及病毒感染小鼠耳蜗上皮细胞模型的建立

MCEC 细胞培养至能够稳定传代的细胞系L10代左右,将细胞铺于25CM2 细胞培养瓶中,待其长满单层后,进行细胞饥饿12h,以使细胞同步化。以MOI=1 接种小鼠巨细胞病毒,37℃孵育90 分钟后,添加含2%FBS 的MECE 培养基继续培养72h,同步设置未接毒的MCEC 细胞为对照组,并将实验组与对照组各进行三次生物学重复,于72h 在普通光学显微镜及荧光显微镜下观察细胞病毒感染情况并记录。

1.3 总RNA 的提取

将感染以及未感染72h 的细胞样品用Trizol 进行裂解,经过氯仿抽提,异丙醇沉淀,乙醇洗涤沉淀等过程对细胞总RNA 进行提取,用分光光度计测量RNA 的浓度,并用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性,-80℃保存。

1.4 RNA 小文库的构建及高通量测序

将经Trizol 处理的感染72h(实验组)和未感染72h(对照组)的细胞样品,交由北京博奥晶典生物技术有限公司完成小RNA 文库构建及高通量测序,检测病毒感染组及对照组miRNA 表达的变化。

1.5 荧光定量PCR 验证高通量测序结果

筛选差异表达明显的miRNA验证,筛选标准:根据测序结果,挑选差异表达倍数FC>10,P<0.01, 已知和新发现的miRNA 中上调最明显的miRNA 各6 个;差异表达倍数FC>2,P<0.01, 已知和新发现的miRNA中下调最明显的miRNA各2个,进行验证。采用miRNA 反转录试剂盒,对1.3 中提取的细胞总RNA进行反转录反应,得到的cDNA 用作荧光定量PCR的模板,选用RNU6 基因作为内参,引物序列见表1,使用相对定量方法验证,计算结果基于2-△△ct法,所有实验进行三次生物学重复。


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1.6 统计学分析

采用SPSS 20.0 对结果进行统计学分析。两组数据为非正态分布计量资料,采用非参数检验Mann-Whitney Test,P<0.05 为差异有统计学意义。用GraphPadPrism 软件进行画图。

1.7 差异miRNA 靶基因功能富集分析

我们基于miRNA 和基因(mRNA)表达差异结果进行联合分析。对预测得到的miRNA 的靶基因进行GO 和KEGG 富集分析,研究miRNA 对于基因表达以及他在生物学进程的调控作用,同时还能对新预测的miRNA 的调控功能做研究。


2 结果


2.1 mCMV感染与未感染72h的小鼠耳蜗上皮细胞

小鼠巨细胞病毒Smith株带有GFP-绿色荧光蛋白标签,可在荧光显微镜下观察其在细胞中的感染情况,见图1。mCMV感染72h时,处于病毒增长的指数期,此时细胞内病毒复制活跃细胞感染率较高。


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2.2 miRNA 差异表达谱

根据小RNA 文库测序比对结果,对感染及未感染mCMV 72h 的小鼠耳蜗感觉上皮细胞差异表达的miRNA 进行分析, 筛选样本间差异表达的miRNA,采用显著性P 值(P - value)和差异倍数(fold-Change,FC)作为差异表达的判断标准:(1)当P≤0.05,且FC≥2(log2(FC)≥ 1),判断为上调Upregulate;(2)当P≤ 0.05,且FC≤0.5(log2(FC) ≤ -1),判断为下调Down-regulate。其结果如图2 所示,共检测到143 个差异表达的miRNA,其中已知的miRNA 有81 个,新发现的miRNA有62 个。已知的miRNA 中共检测到69 个上调的miRNA,12 个下调的miRNA;新发现的miRNA 中,共检测到46 个上调的miRNA,16 个下调的miRNA。


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2.3 筛选差异表达显著的miRNA

筛选标准:测序结果中差异表达倍数FC>10,P<0.01,TOP6 已知和新增上调的miRNA;测序结果中差异表达倍数FC>2,P<0.01,TOP2的已知和新增下调的miRNA,见表2。


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2.4 qPCR 验证差异表达明显的miRNA

对测序得到的差异表达的miRNA,我们对筛选差异表达明显的进行验证。qPCR 结果显示,RNU6及miRNA 产物熔解曲线均为单一曲线,反应特异。mCMV 感染MCEC 72h 后,验证8 个已知的miRNA中,有6 个与测序结果趋势一致,其中5 个为上调,1个为下调趋势,见图3(A);验证8 个新发现的miRNA中,有4 个与测序结果趋势一致,全部为上调趋势的miRNA,见图3(B)。miRNA 的测序结果与qPCR结果趋势基本一致。表明,在mCMV 感染MCEC 过程中miRNA 确实发生了差异表达,其中miR-7b-5p,miR-7a-5p 的差异十分显著,上调约6倍左右,见表3,4,他们在病毒感染细胞的过程中可能发挥着重要的作用。


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2.5 差异表达miRNA 靶基因的富集分析

为了解这些差异表达miRNA的功能,我们对测序结果得到的差异表达的miRNA 靶基因进行功能富集分析。如图4 所示,图中按富集程度列出最靠前的三十个分类项,分析显示:多数差异性表达的miRNA的功能主要参与细胞、生物过程的调控,新陈代谢的调控,以DNA 为模板转录,RNA 合成等生物学过程;主要作为细胞内,核质等细胞成分;主要行使离子结合等分子功能。通过KEGG 分析,如图5 所示:这些差异miRNA 主要参与了感觉系统,免疫系统,病毒传染,信号转导等的信号通路。


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3 讨论


miRNA 是一类内源性18-24 核苷酸(nt)非编码RNA,它们具有转录后调节功能。大量的研究表明,miRNA 参与多种生理过程,包括发育,细胞凋亡和脂肪代谢的调节。它们也被证明与肿瘤和病毒感染的建立和发展相关[11-13]。

在本研究中,我们首先构建mCMV感染小鼠耳蜗感觉上皮细胞的模型,用高通量测序技术来检测mCMV 感染小鼠耳蜗感觉上皮细胞后,处于病毒指数增长期72 小时时miRNA 变化的情况,通过测序发现差异表达的miRNA,进而通过对测序结果进行筛选,用qPCR 验证得到与测序结果趋势一致的6 个已知miRNA,4 个新发现的miRNA。

经qPCR 验证,与测序结果趋势一致的10个miRNA 中,miR-7b-5p 和miR-7a-5p 的差异表达较为明显,他们在病毒感染细胞的过程中可能发挥着重要的作用,值得深入研究。利用miRanda 软件对这两个miRNA 进行miRNA-Target 预测, 其中miR-7b-5p 的靶基因Plpp5,Tcf12,S1pr2,Atrx,Shpk,Luc7l 等得分较高,miR - 7a -5p 的靶基因Cbx4,Shpk,Plpp5,2210011C24Rik 等得分较高。通过对他们的靶基因进行GO 功能显著性富集分析,结果显示,这两个miRNA 在生物学功能上主要参与代谢过程,细胞过程,生物调节过程,以及对刺激的反应。在细胞成分上主要是构成膜,大分子复合物,细胞器部分等。在分子功能上主要行使核酸结合转录因子活性,分子换能器活性,催化活性等分子功能。在KEGG 信号通路分析中,发现这些miRNA的靶基因主要参与神经活性配体-受体相互作用,鞘脂信号通路,氧化应激诱导衰老,细胞对压力的反应等信号通路。以往研究表明,CMV 诱发SNHL与耳蜗细胞炎症反应有关,CMV 感染可引起炎症小体在小鼠内耳组装,这些炎性因子具有神经毒性,可能会导致听力受损[14]。而本研究中发现差异表达的miRNA 靶基因也与免疫系统的信号通路有关。此外又有研究表明,由MCMV 感染引起的听力下降可能与活性氧ROS 引起的炎症有关,MCMV可通过在小鼠耳蜗和培养的SGN 中产生ROS 来激活NLRP3 炎性体[15],而本研究中对经qPCR 验证的两个差异表达明显的miRNA 靶基因功能富集分析中显示他们参与氧化应激诱导衰老的信号通路。

从而可以推测这些差异表达的miRNA可以通过免疫反应,氧化应激等相关通路在CMV 致聋的过程中发挥出重要的作用。由此可见,这些差异表达的miRNA 在巨细胞病毒感染小鼠耳蜗感觉上皮细胞中行使了十分重要的生物学功能。病毒与宿主之间以miRNA 为介质相互拮抗。病毒为了利于复制,而宿主细胞为了对抗病毒感染,他们利用miRNA 作为调控分子相互协调,形成了一张复杂的调控网络,在转录调控,信号转导,过程凋亡等途径中发挥了重要的作用。

高通量测序技术的飞速发展为非编码RNA 的系统研究提供了一个快速可靠的平台。高通量测序技术具有高通量和低单碱基成本的特点, 但是测序读长相对较短是第二代测序技术的主要缺陷[16]。高通量测序技术同时也存在着分析质量的把控,主要包括比对质量、组装质量以及预测miRNA 时产生的假阳性等问题。因此,我们通常需要对高通量测序的结果采用另一技术平台实时荧光定量PCR技术进行验证,由于高通量测序技术与实时荧光定量PCR 技术是不同的技术平台,测序也存在一定的错误率,随着错误的积累,最终导致表达量出现一定程度的偏差。在本研究中,挑选验证的miRNA存在一定比例的低表达,即测序结果表达量读数值RawRC 偏低,这在一定程度上会使验证结果的总体吻合率降低,而从本次研究的结果来看,验证结果的总体吻合率达到60% 以上,基本可以确定测序结果的可靠性。尽管越来越多的学者通过高通量测序技术来研究非编码RNA,但是转录组学的研究尚处在起步阶段,特别对于miRNA 的调控机制,仍然面临着诸多问题与挑战。但是随着未来测序技术和生物信息学的发展,miRNA 在巨细胞病毒感染耳聋过程中的作用机制终将被人们所挖掘。


4 结论


综上所述,本研究应用高通量测序检测出mCMV 感染MECE72h 时miRNA 的差异表达,筛选并验证出差异表达明显的miRNA,利用生物信息学技术对差异表达的miRNA 所具有的生物学功能以及可能参与的信号通路进行预测,从分子水平为探讨CMV 感染导致耳聋发生发展机制提供了新的研究方向,为近一步研究CMV 感染导致耳聋的发生机制提供了有意义的信息。


[责任编辑: 郭勇]